Tác dụng của quả nhân sâm Hàn Quốc đối với việc giảm sắc tố da và chống lão hóa thông qua kích hoạt FoxO3a
0
Tóm tắt lý thuyết
Nền tảng
Quả nhân sâm có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau, bao gồm các đặc tính trị đái tháo đường, chống ung thư, chống viêm và chống oxy hóa. Hơn nữa, chúng tôi đã tiết lộ rằng thành phần chống lão hóa tích cực của quả nhân sâm, syringaresinol (có vai trò như một chất chuyển hóa thực vật), có khả năng kích thích tuổi thọ thông qua kích hoạt gen. Mặc dù nhân sâm có nhiều tác dụng có lợi đã được biết đến, nhưng tác dụng của nó đối với quá trình lão hóa da vẫn chưa được hiểu rõ. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nghiên cứu tác động của nhân sâm và quả nhân sâm đối với một trong các quá trình lão hóa da, sự hình thành hắc tố và sự tích tụ lipofuscin (còn được gọi là sắc tố do tuổi già / sắc tố liên quan đến tuổi tác), để làm sáng tỏ cơ chế hoạt động đối với việc chống lão hóa.
Phương pháp
Dòng tế bào MNT1 khối u ác tính ở người được điều trị bằng chiết xuất rễ nhân sâm, chiết xuất quả nhân sâm hoặc syringaresinol. Sau đó, các tế bào được phân tích bằng xét nghiệm melanin và ước tính hoạt tính tyrosinase (Sắc tố da melanin được bắt nguồn từ tyrosinase). Chủng N2 tự nhiên Caenorhabditis elegans* được sử dụng cho thử nghiệm tuổi thọ để phân tích tác dụng chống lão hóa của các mẫu. Một xét nghiệm huỳnh quang lipofuscin đã được thực hiện trong 10 lần truyền với phương pháp điều trị bằng syringaresinol.
*Caenorhabditis elegans là một loài giun tròn sống tự do (không ký sinh), được sử dụng rộng rãi như một sinh vật mô hình.
Kết quả
Phương pháp điều trị 7 ngày với chiết xuất từ quả nhân sâm làm giảm sự tích tụ melanin và hoạt động của tyrosinase hơn so với chiết xuất từ rễ nhân sâm. Những kết quả này có thể là do hợp chất hoạt động của quả nhân sâm, syringaresinol. Hoạt động chống tạo hắc bào được phối hợp chặt chẽ với việc kích hoạt gen tuổi thọ foxo3a. Hơn nữa, chiết xuất từ quả nhân sâm có tác dụng chống lão hóa mạnh hơn, giúp kéo dài tuổi thọ và giảm tích tụ lipofuscin.
Kết luận
Kết hợp lại với nhau, kết quả của chúng tôi cho thấy rằng các tác dụng chống tạo hắc tố và tác dụng chống lão hóa của quả nhân sâm làm trung gian cho việc kích hoạt tín hiệu chống oxy hóa – FoxO3a.
Từ khóa: chống lão hóa, Caenorhabditis elegans, Nhân sâm, lipofuscin, sắc tố da, quả nhân sâm.
1. Giới thiệu
Một xu hướng gần đây trong việc phát triển các loại thuốc và chất chống lão hóa mới là tìm kiếm các ứng cử viên trong số các sản phẩm tự nhiên vì chúng có độc tính tương đối thấp trong các ứng dụng lâm sàng. Là một loại thảo mộc truyền thống, nhân sâm đỏ là một chất thích ứng giúp phục hồi và cải thiện quá trình lão hóa bình thường. Việc sử dụng cây thảo dược này đã được phổ biến rộng rãi vì tác dụng chữa bệnh của nó. Các tác dụng sinh hóa và dược lý nổi tiếng của nó bao gồm chống ung thư [1], chống mệt mỏi [2] và tác dụng trị đái tháo đường [3], mặc dù nó cũng thúc đẩy quá trình tổng hợp DNA, RNA và protein [4]. Gần đây, nhiều báo cáo về sức khỏe đã khuyến nghị tăng cường ăn trái cây như một phần của chế độ ăn uống lành mạnh [5], [6]. Không giống như rễ nhân sâm được sử dụng rộng rãi, quả nhân sâm được dành riêng để sử dụng trong trồng trọt và không được sử dụng bởi người dân nói chung. Một nghiên cứu gần đây đã báo cáo rằng lá và quả nhân sâm có hàm lượng ginsenoside nhất định cao hơn so với rễ nhân sâm và các hoạt động dược lý của lá và quả nhân sâm cũng đã được báo cáo [7]. Hiện tại, chiết xuất quả nhân sâm đang được đánh giá trong các thử nghiệm lâm sàng và tiền lâm sàng vì quả nhân sâm có hàm lượng cao các hợp chất hoạt tính, đặc biệt là ginsenoside Re và vitamin E [8].
Yếu tố phiên mã xoắn ốc/đầu nhọn lớp O (FoxO) là yếu tố điều hòa quan trọng của các hiện tượng sinh học khác nhau, bao gồm trao đổi chất, tăng trưởng, phát triển và tuổi thọ [9], [10]. Các yếu tố FoxO có liên quan đến tín hiệu tế bào và được kích hoạt bởi các kích thích môi trường khác nhau, chẳng hạn như insulin, các yếu tố tăng trưởng insulin (IGF), oxidative stress*, cytokine** và chất dinh dưỡng.
Notes:
*Oxidative stress chính là nguyên nhân dẫn đến nhiều bệnh lý nguy hiểm ở cơ thể con người như xơ vữa động mạch, ung thư, tiểu đường, tổn thương gan, thấp khớp, đục thủy tinh thể, rối loạn thần kinh trung ương….
**Cytokine là chỉ loại chất tiết của các tế bào bạch cầu và nội mô trong quá trình viêm, là một phần của đáp ứng miễn dịch của cơ thể. Cytokine không phải là kháng thể, cũng không phải là hormon, nhưng là các chất có hoạt tính sinh học rất mạnh, có tầm tác dụng tại chỗ, nên còn gọi một cách không chính thức là các “hormon tế bào”.
Mục đích của nghiên cứu này là khám phá các hợp chất kích hoạt FoxO3a có nguồn gốc từ cây thuốc phương Đông và cung cấp bằng chứng khoa học về tác dụng chống tạo hắc tố và chống lão hóa của các chất kích hoạt. Chúng tôi đã đưa ra giả thuyết rằng chiết xuất quả mọng nhân sâm và thành phần syringaresinol của nó có thể là chất chống lão hóa và chống lão hóa mới, đồng thời chúng tôi tiết lộ một cơ chế phân tử khả thi cho tác dụng của chúng. Chúng tôi đã chỉ ra rằng chiết xuất quả mọng nhân sâm làm giảm sự tích tụ melanin cũng như chiết xuất rễ nhân sâm, và tác dụng này chủ yếu bắt nguồn từ thành phần hoạt chất syringaresinol của quả nhân sâm. Khi chiết xuất rễ nhân sâm, chiết xuất quả nhân sâm và syringaresinol thể hiện các hoạt động chống oxy hóa, tiếp theo chúng tôi đã nghiên cứu mối quan hệ của chúng với protein gen chống lão hóa FoxO3a. Các thành phần nhân sâm này gây ra sự chuyển vị hạt nhân của FoxO3a, dẫn đến việc kích hoạt các gen chống lão hóa. Để xác nhận tác dụng chống lão hóa của các thành phần nhân sâm, chúng tôi đã xác định các đồ thị sống sót của sinh vật mô hình lão hóa Caenorhabditis elegans khi được điều trị bằng các thành phần từ quả nhân sâm. Chúng tôi đã chỉ ra rằng các thành phần nhân sâm này đã kéo dài tuổi thọ của chủng N2 tự nhiên. Hơn nữa, điều trị bằng syringaresinol từ quả nhân sâm làm giảm sự tích tụ của sắc tố lipofuscin liên quan đến tuổi tác trong các nguyên bào sợi ở da người.
2. Vật chất và phương pháp
2.1. Nuôi cấy tế bào và chủng C. elegans (Caenorhabditis elegans)
Chủng dại C. Elegans N2 được Trung tâm Di truyền Caenorhabditis (Đại học Minnesota, Minneapolis, MN, Hoa Kỳ) thu được. Các chủng C. elegans được duy trì ở 20°C. Giun nở (ấu trùng giai đoạn bậc 1) được gieo vào các đĩa thạch tươi và nuôi cấy ở 20°C với Escherichia coli OP50 làm nguồn thức ăn cho đến khi chúng đạt đến giai đoạn ấu trùng L4.
2.2. Panax ginseng* và chiết xuất quả nhân sâm
*Panax ginseng (Nhân sâm) là một loại cây mọc ở Hàn Quốc, Đông Bắc Trung Quốc, và vùng biển đông Siberia. Người ta dùng rễ để làm thuốc.
Sau khi nhân sâm Panax tươi và quả nhân sâm được rửa sạch bằng nước, hạt được loại bỏ và phần còn lại (bột và vỏ) được thu thập. Sau khi chiết xuất bằng etanol 70% trong điều kiện hồi lưu trong 10 giờ, dịch chiết được lọc và làm bay hơi. Sau đó, dung dịch chiết xuất được đông khô để thu được trạng thái bột của chiết xuất quả nhân sâm và được bảo quản ở -20°C cho đến khi sử dụng. Để chuẩn hóa và so sánh thành phần ginsenoside, quá trình phân tách sắc ký được thực hiện bằng hệ thống ACQUITY UPLC (Waters Co., Milford, MA, USA). Cột là cột ACQUITY UPLC BEH C18 (1,7 μm, 2,1 mm × 50 mm). Nhiệt độ cột và nhiệt độ khay lấy mẫu tự động được duy trì tương ứng ở 40°C và 10°C. Dữ liệu được thu thập và phân tích với MassLynx phiên bản 4.1 (Waters Co.).
Xem đầy đủ các bước phân tích khác tại [Bản gốc chưa dịch]: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5489743/
3. Phân tích và thử nghiệm
3.1. Quả nhân sâm và thành phần hoạt tính sinh học Syringaresinol của nó có hoạt tính chống lại sự hình thành tế bào
Gần đây, nhiều nghiên cứu đã chứng thực việc tăng lượng trái cây ăn vào như là một phần của việc bổ sung lành mạnh [22]. Quả mọng là nguồn cung cấp kali hoặc chất xơ dồi dào, và các báo cáo gần đây đã chỉ ra rằng quả mọng chứa nhiều chất phytochemical có phổ hoạt tính sinh học rộng và tác động tích cực đến sức khỏe cộng đồng [23], [24]. Một nghiên cứu gần đây đã báo cáo rằng lá và quả nhân sâm có hàm lượng ginsenoside nhất định cao hơn so với rễ nhân sâm và các hoạt động dược lý của quả nhân sâm cũng đã được báo cáo [7].
Để tìm ra các hợp chất tự nhiên từ chiết xuất nhân sâm có tác dụng chống lại sự hình thành hắc tố, chúng tôi đã thực hiện thử nghiệm tích lũy hắc tố bằng cách sử dụng các tế bào khối u ác tính ở người, dòng tế bào MNT1, rễ nhân sâm và chiết xuất từ quả nhân sâm. Từ kết quả của thử nghiệm này, người ta thấy rằng chiết xuất quả nhân sâm và chiết xuất rễ nhân sâm ức chế sự tích tụ melanin mà không gây độc (Hình 1A, 1B).
Rễ nhân sâm và chất chiết xuất từ quả nhân sâm ức chế sự tích tụ melanin bằng cách giảm hoạt động của tyrosinase:
- (A) Các tế bào MNT1 được xử lý bằng chiết xuất rễ nhân sâm hoặc chiết xuất quả nhân sâm trong 48 giờ và mức độ melanin được hiển thị sau khi hòa tan các viên tế bào trong NaOH 1N.
- (B) Nồng độ melanin được định lượng trong các viên tế bào hòa tan bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 490nm bằng máy quang phổ UV-vis (Thiết bị phân tử, Sunnyvale, CA, Hoa Kỳ) và được chuẩn hóa thành đầu vào protein.
- (C) Hoạt tính tyrosinase được đo ở bước sóng 490 nm bằng cách sử dụng máy quang phổ UV-vis với melanin được tổng hợp từ L-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) bởi tyrosinase có trong lượng ly giải tế bào bằng nhau (10 μg). Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn. * p <0,05 bằng bài kiểm tra t Sinh viên hai đuôi.
Sự hình thành hắc tố được bắt đầu bởi quá trình oxy hóa do tyrosinase xúc tác [25]. Kết quả là chiết xuất quả nhân sâm ức chế sự tích tụ melanin cũng như hoạt động tyrosinase nội bào nhiều hơn so với chiết xuất rễ nhân sâm cùng nồng độ (Hình 1A–1C).
Có một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng quả nhân sâm có hàm lượng ginsenoside cao hơn so với rễ [23]. Ngoài ra, quả nhân sâm không chỉ có tác dụng giống như rễ nhân sâm mà còn có nhiều hoạt tính sinh học đặc hiệu khác [26]. Do có nhiều hoạt tính sinh học mạnh mẽ, đã có nhiều nỗ lực khám phá các thành phần hữu ích khác trong quả nhân sâm bên cạnh ginsenosides.
Gần đây, một hợp chất lignan, syringaresinol {4,4′-(1S,3aR,4S,6aR)-tettrahydro-1H,3H-furo [3,4-c]furan-a,4-diylbis (2,6-dimethoxyphenol)}, được phân lập từ bột nhân sâm Panax và được phát hiện là kích hoạt biểu hiện gen SIRT1, dẫn đến làm chậm quá trình lão hóa tế bào và cải thiện chức năng tế bào nội mô trong các tế bào nội mô [27]. Vì syringaresinol có tác dụng bảo vệ chống lại tổn thương do thiếu oxy/tái oxy hóa [28], tương quan chặt chẽ với stress oxy hóa, chúng tôi suy đoán rằng tác dụng chống tạo hắc tố mạnh của quả nhân sâm có thể là do syringaresinol – thành phần hoạt tính sinh học của quả nhân sâm.
Để xác minh rằng syringaresinol là yếu tố chính trong việc ức chế sự hình thành hắc tố, chúng tôi đã đo hàm lượng ginsenoside và syringaresinol trong rễ nhân sâm và chất chiết xuất từ quả nhân sâm bằng phương pháp HPLC [29]. Syringaresinol chỉ được tìm thấy trong chiết xuất quả nhân sâm (Hình 2A). Ngoài ra, chúng tôi đã thực hiện xét nghiệm melanin với thành phần nhân sâm, bao gồm cả syringaresinol. Kết quả là, sự tích tụ melanin bị ức chế mạnh bởi syringaresinol (Hình 2B, 2C) và hợp chất này cũng ức chế hoạt động tyrosinase (Hình 2D). Những kết quả này cho thấy tác dụng chống tạo hắc tố của quả nhân sâm chủ yếu bắt nguồn từ thành phần hoạt chất syringaresinol của quả nhân sâm.
Chiết xuất quả mọng nhân sâm làm giảm quá trình hình thành hắc tố bằng cách ức chế hoạt động tyrosinase, và tác dụng này chủ yếu bắt nguồn từ thành phần hiệu quả của nó, syringaresinol:
- (A) Lượng syringaresinol trong rễ nhân sâm hoặc chiết xuất quả nhân sâm. Giá trị trung bình (ug/mL) được trình bày. Nồng độ melanin được hình dung sau khi hòa tan các viên tế bào trong NaOH 1N (B) và định lượng (C).
- Hoạt tính tyrosinase cũng được đo (D). Rễ nhân sâm, chiết xuất quả nhân sâm hoặc syringaresinol được sử dụng để xử lý tế bào MNT1 trong 48 giờ. Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn. * p <0,05 bằng bài kiểm tra t của Sinh viên hai đuôi.
3.2. Chuyển vị hạt nhân tăng cao của FoxO3a bằng syringaresinol là một cơ chế chính để ức chế quá trình tạo hắc tố.
Các hợp chất lignan thường xuất hiện trong thực vật và đại diện cho một loạt các tác dụng tăng cường sức khỏe, chẳng hạn như các đặc tính chống oxy hóa, chống ung thư và kháng vi-rút [30], [31], [32]. Vì một số bước oxy hóa xảy ra trong quá trình tổng hợp melanin, nên chúng tôi đã đo lường tác dụng chống oxy hóa của syringaresinol bằng cách phân tích các hoạt động nhặt gốc DPPH và hydro peroxide của nó. Mặc dù chất chiết xuất từ rễ nhân sâm và quả nhân sâm cho thấy hoạt động loại bỏ các loại oxy phản ứng (ROS), syringaresinol thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh (Hình 3A, 3B).
Trong báo cáo trước đây của chúng tôi [17], chúng tôi đã chỉ ra rằng hoạt động chống tạo tế bào hắc tố của các chất chống oxy hóa được trung gian bởi sự kích hoạt gen tuổi thọ, FoxO3a, thông qua chuyển vị nhân của nó. Dựa trên kết quả của chúng tôi, tác dụng chống tạo tế bào hắc tố của chất chống oxy hóa phối hợp tốt với kích hoạt FoxO3a. Kích hoạt FoxO3a được gây ra bởi sự chuyển vị hạt nhân của nó; do đó, chúng tôi đã thực hiện các xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang để phân tích nội địa hóa của nó. Việc tăng nồng độ của từng dẫn xuất nhân sâm (chiết xuất rễ nhân sâm, chiết xuất quả nhân sâm và syringaresinol) gây ra sự chuyển vị nhân của FoxO3a, cho thấy sự làm giàu dần dần của FoxO3a trong nhân (Hình 4A, 4B). Tốc độ dịch chuyển hạt nhân của FoxO3a được phối hợp tốt với việc giảm mức độ melanin (Hình 2, Hình 4B). Những kết quả này cho thấy rằng tác dụng chống tạo hắc tố của các thành phần nhân sâm được trung gian chủ yếu bằng cách kích hoạt yếu tố chống tạo hắc tố FoxO3a.
Rễ nhân sâm, quả nhân sâm và syringaresinol gây ra sự chuyển vị hạt nhân của FoxO3a.
- (A) Các thành phần nhân sâm được chỉ định đã được thêm vào các tế bào MNT1 trong 48 giờ. Các tế bào được nhuộm bằng kháng thể antiFoxO3a (FoxO3a; màu đỏ) và 4′,6–diamidino–2–phenylindole (DAPI) (nhân; màu xanh lam). Hình ảnh đại diện thu được bằng kính hiển vi quét laser đồng tiêu (LSM7, Carl Zeiss, NY, USA) và được hợp nhất.
- (B) Các tế bào có nội địa hóa FoxO3a được đếm và mô tả bằng kính hiển vi quét laser đồng tiêu. Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn. Thanh tỷ lệ = 100 m. Ph, hình ảnh tương phản pha.
3.3. Tác dụng chống lão hóa của quả nhân sâm ở C. Elegans và tăng sinh nguyên bào sợi của con người
Mặc dù có nhiều hoạt động sinh học được báo cáo đối với lignans [30], [31], [32], [33], [34], nhưng đáng ngạc nhiên là có rất ít báo cáo về tác dụng chống lão hóa của syringaresinol. Chúng tôi đã sử dụng chủng N2 tự nhiên C. Elegans như một sinh vật mẫu về lão hóa để kiểm tra tác dụng kéo dài tuổi thọ của chiết xuất quả mọng nhân sâm và syringaresinol. Syringaresinol đã kéo dài tuổi thọ của N2 từ 27,8% đến 38,1% trong phạm vi liều 250–500nM (Hình 5A, 5B và Bảng 1). Tác dụng của syringaresinol được so sánh với tác dụng của chiết xuất rễ nhân sâm (7,3% và 17,8% ở 10–50 μg/mL) và chiết xuất quả nhân sâm (17,2% và 23,6% ở 10–50 μg/mL). Những khác biệt này cũng phối hợp tốt với tỷ lệ nội địa hóa hạt nhân FoxO3a (Hình 4, Hình 5B). Chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng tác dụng kéo dài tuổi thọ của các thành phần nhân sâm có thể bắt nguồn từ các hoạt động kích hoạt gen kéo dài tuổi thọ của chúng.
Các thành phần nhân sâm có hoạt tính chống lão hóa mạnh. Rễ nhân sâm, quả nhân sâm và syringaresinol tạo ra sự kéo dài tuổi thọ ở chủng Caenorhabditis elegans loại N2 tự nhiên. Các đồ thị sinh tồn (A) và tuổi thọ trung bình (B) được trình bày ở hình trên. Dữ liệu được phân tích thông qua phân tích tỷ lệ sống của Kaplan–Meier. Dữ liệu đại diện cho một thử nghiệm với hai lần lặp lại bổ sung. (C, D) Các thành phần nhân sâm làm giảm sự tích tụ lipofuscin trong các nguyên bào sợi ở da người. Các nguyên bào sợi ở da của một phụ nữ 28 tuổi và một nam giới 56 tuổi được điều trị bằng 100–500nM syringaresinol trong 10 lần truyền, và lượng lipofuscin tích lũy liên quan đến tuổi tác được đo (C) và hiển thị (D). Mức lipofuscin tích lũy được phát hiện bằng kính hiển vi quét laze đồng tiêu (Ví dụ: 350 nm; Em: 420 nm). Cường độ huỳnh quang của các ô được tính theo mật độ bằng cách đo cường độ pixel trung bình trong mỗi ô. Dữ liệu được trình bày dưới dạng độ lệch chuẩn trung bình ± của ba thí nghiệm độc lập.
Chú thích:
- GB: chiết xuất quả nhân sâm;
- GR: chiết xuất rễ nhân sâm;
- SYR: syringaresinol.
Table 1
Các thành phần nhân sâm giúp kéo dài tuổi thọ của Caenorhabditis elegans (1)
| Điều trị | Tuổi thọ của người trưởng thành (Trung bình ± SD) | N | % so với biến dạng kiểm soát | p so với căng thẳng kiểm soát | Tuổi thọ trưởng thành tối đa |
|---|---|---|---|---|---|
| Control | 16.2 ± 3.0 | 90 | – | – | 24 |
| GR 10 μg/mL | 17.4 ± 3.3 | 87 | 7.3 | 0.2374 | 24 |
| GR 50 μg/mL | 19.1 ± 4.5 | 90 | 17.8 | 0.0823 | 26 |
| GB 10 μg/mL | 19.0 ± 4.1 | 88 | 17.2 | 0.0013 | 28 |
| GB 50 μg/mL | 20.1 ± 4.0 | 92 | 23.6 | 8.9E–06– | 30 |
| SYR 250nM | 20.8 ± 3.9 | 93 | 27.8 | 1.4E–07 | 30 |
| SYR 500nM | 22.4 ± 4.1 | 95 | 38.1 | 4.3E–08 | 34 |
4. Kết luận
Chiết xuất quả mọng nhân sâm và syringaresinol thành phần hóa học thực vật tự nhiên của quả nhân sâm cho thấy tác dụng chống tạo hắc tố trên dòng tế bào u ác tính ở người, kéo dài tuổi thọ của sinh vật mô hình lão hóa C. elegans và giảm sự tích tụ của sắc tố lipofuscin liên quan đến tuổi tác trong nguyên bào sợi ở da người. Những tác dụng này có thể là do hoạt động chống oxy hóa mạnh và kích hoạt gen trường thọ foxo3a. Những dữ liệu này cho thấy rằng hoạt tính chống lại sắc tố da và chống lão hóa của chiết xuất quả nhân sâm được tạo ra bởi sự kích hoạt của gen tuổi thọ FoxO3a có thể là một mục tiêu tốt để nghiên cứu các con đường truyền tín hiệu chống tạo hắc tố bằng cách sử dụng các thành phần quả nhân sâm và để thiết kế các tác nhân dược lý hoặc chống tạo hắc tố điều chỉnh tín hiệu chống lão hóa.
Xung đột lợi ích
Các tác giả tuyên bố rằng họ không có xung đột lợi ích.
Sự nhìn nhận
Các tác giả rất biết ơn Trung tâm di truyền Caenorhabditis về các chủng C. Elegans.
